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生物实验室那些小细节~

更新时间:2017-11-12      点击次数:1294

平时在实验室常听到的一句话就是“今天某某试验没做好是为什么?今天某某试验没出结果是什么原因?今天某某试验为什么会是这样的呢?” 等等。

然后仔细一查找原因,往往是由于操作上面的不认真,或是一些小小的细节没有注意到。以下是集各路朋网友的一些实战经验,在此与大家分享:

1. 跑page胶的时候

小电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形。低电压泳道会比大电压泳道跑的直一些,且分离效果更高,有利于分子量相差不大的蛋白分离。

 

2. 提取质粒的时候

后一步的酒精挥发很关键,基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间,是空调吹热风,或是37度温箱放长一点的时间,我试过室温过夜,酶切很好。

 

3. 做WESTERN BLOT 的时候

大家往往会摸索一抗、二抗的浓度,封闭时间,曝光时间等等,而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜,甚至重新提蛋白,这样会浪费大量的时间。其实*没有必要这样。一次转膜后,将PVDF膜晾干,裁减成小块,保存起来,用的时候取出一块,没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说,节约了大量的时间。

 

4. 有关缓冲液和培养基配置

1)将缓冲液配方中的成分分别以10-100倍配成母液储存,需要的时候只需将相应的母液混合,补加水稀释即可。

2)配培养基时通常会忘记各成分的量,如配LB时的三个成分不记得到底哪个是5g,哪个要10个,因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量,如配LB时,在NaCl瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等,很方便,不需要每次配之前临时翻书。

 

5. 有关PCR主反应液配置

在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行PCR鉴定,每次配置PCR反应液很繁琐,可以将其配置类似kit的形式,按你需要的反应体系列表,然后放大100倍配置100×主反应液(100次反应),其中含buffer,Mg2+,dNTPs,但不含引物和Taq酶,然后可以10×分装或一管储存在-20度,在需要的时候拿出融开,然后按所需的PCR反应个数吸取相应的倍数,再补加相应反应倍数的Taq和引物,混匀后分装,这样做的好处如下:

1)可极大的节省宝贵的时间,可早点收工,看球;

2)避免每次反应加样不均的可能;

3)大大减少PCR假阳性的产生。

 

6. 有关酶切反应液的配置

在做酶切时,也可以象PCR一样配置主反应液,每次反应前先列好反应的体系,算好需要的反应数,然后按所需反应的体系按所需反应数放大,加入buffer、酶、水,质粒栏空缺,然后混合后按除质粒DNA的体积分装,然后再在每管中加入相应体积的质粒DNA酶切,这样做的好处如下,特别是当同时有10几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显:

1)各反应成分均一;

2)可大大减少限制型内切酶的使用;

3)节省时间。

 

7. 有关SDS-PAGE:

1)可将SDS-PAGE的积层胶,分离胶预先配好大体积如100ml储存在4度冰箱(注:10%AP,TEMED不加,切记!!!),每次配置时只需吸取相应体积的预制胶加入AP,TEMED即可,没必要每次制胶时候翻分子克隆,特别方便,而且,这样的预制胶可储存半年以上,不失为偷懒的方法;更关键的是可大大减少与丙稀酰胺的接触,因此大大减少中毒的机会。2)电泳时虽然小电泳分离效果要好一些,但2小时以上的等待的时间实在是痛苦,因此可以提高电泳至150V,但需要将整个电泳槽放在放满冰水的脸盆里散热,这样跑出来的胶分离效果丝毫不比低电压来的差,关键是时间大大节省,不需1h即可看结果了。

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